Ao olhar para a obra, analisamos cada expressão facial e corporal dos apóstolos após anunciada a frase de Jesus Cristo que percorre com horror cada um deles. Da esquerda para a direita: Bartolomeu levanta-se de sobressalto e coloca as mãos em cima da mesa, parece que quer saber quem é; Tiago Menor está a colocar a sua mão esquerda no ombro de Simão Pedro, pedindo talvez a sua atenção; André está a olhar para Jesus Cristo e corporalmente exibe as suas mãos em sinal de defesa, o que nos leva a pensar que está a afirmar que não é ele o traidor; Judas Iscariotes está a pegar num pedaço de pão com a mão esquerda e com a mão direita está a agarrar de forma feroz um punhado de moedas; Pedro está a esconder na mão direita uma faca, para proteger Jesus Cristo, e com a mão esquerda chama a atenção de João, o apóstolo mais querido de Jesus Cristo; João pergunta a Jesus Cristo quem é o traidor e este diz-lhe que é o receptor do pão que ele vai molhar e dar, Judas Iscariotes.

segue-se Tomé, que tem o dedo indicador apontado para Jesus Cristo implorando a verdade daquelas palavras; Tiago Maior tem os braços abertos mostrando ao espectador o seu espanto; Filipe coloca as mãos sobre o peito, dando a entender que não tem nada a ver com a traição anunciada, Mateus, Simão e Zelote estão a dialogar à parte do restante plano. Mateus aponta com as duas mãos para Jesus Cristo, mas mantêm a postura virada para Simão e Zelote, Simão está virado para Zelote como se estivesse a perguntar algo e Zelote tem as mãos à frente do seu corpo a gesticular. Não é evidente na obra, mas após Jesus anunciar um traidor, Judas Iscariotes, desmascarado, sai.

A fisionomia para expressar emoções interessou tanto a Leonardo da Vinci, que este começou uma intensa investigação anatómica. Já em 1489 tinha estudado a estrutura do crânio. Pegou num crânio, fez linhas tendo como pontos de referência cavidades ósseas e algumas saliências, situou o chamado «sentido comum», e coincidiu com a alma. Também o sangue era importante para Leonardo, pois era a conotação com o corpo.