Catarina de Habsburgo nasceu a 14 de Julho de 1507, em Torquemada, a caminho de Granada, onde a sua mãe, filha de Joana I de Castela, a Louca, ia levar o caixão do marido, Filipe de Habsburgo, o Belo. Foi a sexta e última filha da rainha Louca, cognome conectado com a loucura em que D. Joana envolveu o transporte do caixão do marido, assim como a preservação do seu corpo. O seu pai, e avô de Catarina, viu-se obrigado a trancar a filha e a neta em Tordesilhas, em 1509, onde foram sujeitas às muitas humilhações provocadas pelos criados contratados por Fernando de Aragão com o fim de controlarem os actos da sua filha. Mesmo com a morte de seu pai e com a subida do seu filho ao trono de Espanha, D. Joana não se livrou da sua clausura até a chegada da sua morte. Esteve presa 46 anos.

Em 1525, com muita tristeza, Catarina teve que se separar da sua mãe para casar com o seu primo D. João III de Portugal, enteado da sua irmã D. Leonor, a mulher de D. Manuel, o Venturoso. Casaram em Fevereiro de 1525, no Crato, e um ano depois, nasceu o primeiro filho dos reinantes, Afonso, um bebé frágil, que inspirava cuidados. Acabou por falecer. D. João e D. Catarina tiveram uma numerosa prole de filhos (Afonso morreu em criança, Maria casou com Filipe II de Espanha e morreu no parto a 12 de Agosto de 1545 dando à luz o seu filho Carlos, a Isabel, a Beatriz, o Manuel e o Filipe morreram em criança, João e António morreu em criança) que, ao longo dos anos, foram falecendo, um por um, sobrando apenas o príncipe João, casado com D. Joana, filha de Carlos V e da imperatriz Isabel. O futuro rei de Portugal acaba por ter o mesmo desfecho dos seus irmãos, tendo, neste caso, falecido meses depois de ter sido diagnosticado uma forma grave de diabetes. A sua morte foi escondida de D. Joana, pois esta estava a poucos dias de dar à luz o primeiro neto dos monarcas, D. Sebastião.

Entretanto, falece D. João III a 11 de Janeiro de 1557, com 55 anos, deixando D. Catarina de Habsburgo como regente do reino e tutora do futuro rei de Portugal, até o tio do príncipe assumir este cargo por cansaço de D. Catarina. A filha de D. Joana, a Louca, que acompanhou a clausura da sua mãe durante 18 anos até vir para Portugal, falece 12 de Fevereiro de 1578.