Ana Bolena foi a filha de Sir Tomás Bolena, Conde de Wiltshire e de Isabel Howard, herdeira do Duque de Norfolk. Tomás Bolena era um mestre em línguas respeitado e um dos conselheiros prediletos do rei Henrique VII, tendo sido mandado em muitas missões pelo mundo a fora. É muito complicado falar a data de aniversário de Ana, pois não é encontrado em livros paroquiais e os dados atuais são contraditórios.

Acreditam que tenha nascido entre 1500 e 1508. Um historiador siciliano, alegou que em 1600 ela teria nascido em 1499, mas William Roper, herdeiro de Thomas More disse que Ana nasceu em 1513. Também não está certo quando seus dois irmãos vieram ao mundo, mas tudo indica que sua irmã, Maria Bolena, era mais primeira filha do casal Tomás e Isabel.

Os filhos de Maria afirmaram que sua mãe era irmã mais velha. Seu irmão Jorge nasceu em 1503. Quando pequena, era chamada Anne de Nany por familiares.

Ana foi alfabetizada na Holanda, no reino de Margarida, Arquiduquesa da Áustria. Por volta de 1515, foi para a corte francesa onde virou uma das damas de cia da rainha Cláudia de Valois (mulher de Francisco I), onde conheceu e adquiriu o idioma francês e se encantou com a cultura e educação desse país. Esta época se revelaria muito importante na formação do seu ego.

Em fevereiro de 1523, Ana voltou à Inglaterra por pedido do seu pai e entrou como dama de Catarina de Aragão, a esposa do rei Henrique VIII , Maria Bolena, era no momento a amante "legítima". Neste período, Ana teve uma relação com Henry Percy, o herdeiro do Conde de Northumberland, e os dois ficaram noivos em segredo. O casamento foi negado pelo pai de Percy por motivos incoerentes e Ana foi distanciada do reino.Em maio de 1523, estava de volta e no próximo ano, substituiu Maria como amante do rei.

A princípio, Ana o encantou, encorajou todos os avanços de Henrique VIII, mas não gostava de ser a amante, queria ser rainha da Inglaterra. O fato de Maria ter tido com o Rei um casal de filhos o encorajou a vontade de se casar de novo para ter filho legítimo, já que rainha oficial não parecia ser capaz de ter um filho homem para a casa de Tudor.